那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下WB實(shí)驗(yàn)中化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的使用:
一般的WB檢測(cè)過(guò)程中,都會(huì)有膜的封閉、一抗孵育、二抗孵育和底物顯色這四道“加工”工序。后面的底物顯色是關(guān)鍵的一部,也是有文章可作的一個(gè)部分。
WB顯色的方法主要有放射自顯影、底物化學(xué)發(fā)光ECL、底物熒光ECF和底物DAB呈色四種方法,發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL,操作比較簡(jiǎn)單,只需要購(gòu)買現(xiàn)成的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒即可。試劑盒中一般使用的反應(yīng)底物A和B分別是魯米諾(又名發(fā)光氨) 和過(guò)氧化氫,原理如下(二抗用HRP標(biāo)記):在HRP的催化作用下,魯米諾與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成一種過(guò)氧化物,過(guò)氧化物不穩(wěn)定隨即分解,形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài),就會(huì)產(chǎn)生熒光,可用X膠片和成像設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。使用傳統(tǒng)的X膠片顯影方法進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)時(shí),后面需要使用暗室曝光來(lái)進(jìn)行ECL檢測(cè),但是建造暗室浪費(fèi)空間,在暗室中曝光步驟繁瑣,沖洗X光片時(shí)會(huì)接觸有毒的化學(xué)藥劑?;瘜W(xué)發(fā)光成像設(shè)備能夠?qū)CL發(fā)光直接成像,獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果,避免暗室曝光的不便。
是否能夠拍攝到ECL的圖像主要取決于設(shè)備是不是帶有制冷的CCD,只有制冷的CCD才夠靈敏地捕捉到膜上發(fā)出的光。隨著Cooled-CCD技術(shù)的發(fā)展,成像系統(tǒng)成本越來(lái)越低,因而在現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)室里這些設(shè)備越來(lái)越普遍。本實(shí)驗(yàn)室目前采用的是化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),具有靈敏度高,成像速度快、成像效果清晰等優(yōu)點(diǎn)。
該儀器的使用非常簡(jiǎn)單:
1)在使用前開(kāi)機(jī)預(yù)冷,待儀器溫度降到-20℃才可以進(jìn)行檢測(cè);
2)將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒中的A和B按照1:1混合;
3)PVDF膜正面朝上放于暗箱,用移液槍將發(fā)光液均勻地涂在膜上,關(guān)閉暗箱箱門(mén),進(jìn)行曝光;
4)曝光可以自動(dòng)曝光,也可手動(dòng)曝光,一般先點(diǎn)擊自動(dòng)曝光,觀察成像效果,若不理想可再手動(dòng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間;另外該儀器還具有多張拍攝模式,可將一張膜在不同的曝光時(shí)間下連拍6張,使曝光更方便。內(nèi)參一般顯影15s(影像條帶粗細(xì)深淺一致說(shuō)明內(nèi)參已調(diào)齊),內(nèi)參好說(shuō)明各步實(shí)驗(yàn)操作均無(wú)誤,即可進(jìn)行后續(xù)的目的蛋白檢測(cè),目的蛋白結(jié)果的好壞就取決于其表達(dá)量以及抗體的特異性和效價(jià)了。 與X膠片相比,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)具有瞬時(shí)影像處理、立即輸出、不需要膠片處理裝置及暗室等成本花費(fèi)、可用軟件半定量分析等優(yōu)點(diǎn),因而在現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)室里化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的使用已經(jīng)逐漸取代傳統(tǒng)的暗室壓片曝光檢測(cè)。
以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于WB實(shí)驗(yàn)中化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的使用。
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